Un modelo predictivo inmunitario para la eliminación del VHB: validación en cohortes multicéntricas y perspectivas mecanicistas a partir de estudios in vivo | Revista de Virología | Texto completo

Revista de Virología volumen 22, Número de artículo: 153 (2025) Citar este artículo

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La infección crónica por VHB es un factor de riesgo importante para el carcinoma hepatocelular y supone una carga significativa para la salud mundial. Sin embargo, los modelos predictivos de la eliminación del VHB basados en biomarcadores inmunitarios siguen siendo limitados.

Desarrollamos sistemáticamente una herramienta predictiva cuantificando los niveles de expresión de ARNm de factores de transcripción del subconjunto de células T CD4⁺, citocinas y puntos de control inmunitarios en PBMC de pacientes con VHB crónico e individuos con VHB resuelto mediante RT-qPCR. Se construyó un modelo de regresión logística binaria en la cohorte de entrenamiento, cuyo rendimiento se evaluó mediante curvas ROC y de calibración, seguido de una validación interna y externa en cohortes independientes. Para la validación in vivo, se estableció un modelo murino transfectado con VHB mediante inyección rápida en la vena de la cola del plásmido pGL3-CP-Fluc-HBV1.2C2. Los resultados incluyeron el peso corporal, los niveles de HBsAg/ADN del VHB y la actividad de la luciferasa. El análisis de Kaplan-Meier evaluó las tasas de aclaramiento acumulativo, mientras que la RT-qPCR rastreó la dinámica del ARNm relacionada con el modelo en PBMC.

El modelo identificó a GATA3, FOXP3, IFNG, TNF y HAVCR2 como genes clave, lo que demostró una sólida precisión predictiva para la eliminación del VHB. Se observaron patrones temporales de regulación génica inmunitaria específicos de la dosis, lo que reveló mecanismos inmunomoduladores distintos entre los grupos.

Este estudio establece un modelo predictivo inmunológico confiable para la eliminación del VHB y destaca respuestas inmunes divergentes en la infección crónica versus la infección resuelta.

El virus de la hepatitis B (VHB), agente causal de la hepatitis B, es una de las principales causas de hepatitis B crónica (HBC), cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (CHC) en todo el mundo [1]. Según la Organización Mundial de la Salud, más de 296 millones de personas padecen infección crónica por VHB, y cada año se producen 1,5 millones de nuevas infecciones [2]. El daño hepático persistente causado por la HBC provoca inflamación hepática progresiva, fibrosis extensa e incluso cáncer [3]. Actualmente, la infección crónica por VHB es la principal causa de CHC en China, lo que supone una carga significativa para los pacientes, las familias y la sociedad [4].

La interacción entre la replicación del VHB y el sistema inmunitario del huésped determina el resultado de la infección, ya sea la eliminación aguda del VHB o la persistencia crónica del VHB [5]. En comparación con la infección aguda por VHB, la respuesta inmunitaria del huésped es significativamente más débil en la infección crónica por VHB, lo que hace que la restauración de la función inmunitaria del huésped sea más crítica que la simple supresión de la replicación viral [6]. La inmunidad adaptativa desempeña un papel clave en el control de la infección por VHB: las células T específicas del VHB se activan con la ayuda de las células presentadoras de antígenos (CPA) y secretan citocinas antivirales como IFN-γ y TNF-α, que inducen respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) para matar a los hepatocitos infectados por VHB [7]. Además, las células B se diferencian en células plasmáticas bajo la guía de las células T auxiliares foliculares (Tfh), produciendo anticuerpos específicos [8]. Aunque gran parte de la investigación se ha centrado en las células T CD8+ citotóxicas, las células T CD4+ son igualmente cruciales para la depuración viral, ya que la generación de células T CD8+ eficaces y el mantenimiento de las células T de memoria funcionales dependen de las células T CD4+ [9]. Durante una respuesta inmunitaria a una infección por patógenos, los linfocitos T CD4+ se diferencian en varios subconjuntos de células T auxiliares, como T auxiliar 1 (Th1), T auxiliar 2 (Th2), T auxiliar 17 (Th17) y células T reguladoras (Treg) [10, 11]. Esta diferenciación está impulsada por un conjunto de factores de transcripción que activan o reprimen genes clave, controlando el desarrollo de diferentes linajes de células inmunitarias. Factores de transcripción específicos como el factor de transcripción T-box 21 (T-bet), la proteína 3 de unión a GATA (GATA-3), el receptor huérfano gamma t relacionado con RAR (RORγt) y Forkhead box P3 (Foxp3) son cruciales para el desarrollo de células Th1, Th2, Th17 y Treg, respectivamente [12, 13]. Las citocinas, como componentes esenciales de la función inmunitaria, desempeñan papeles en la patogénesis, el agotamiento inmunitario y la eliminación viral en la infección crónica por VHB [14]. Los interferones (IFN) y los factores de necrosis tumoral (TNF) son particularmente importantes en los diversos procesos de la infección crónica por VHB. Estudios recientes han indicado que el agotamiento funcional de las células T específicas del VHB puede ser un mecanismo que conduce a la infección crónica por VHB. La expresión de receptores coinhibitorios en células T agotadas aumenta significativamente, lo que está estrechamente relacionado con la falta de respuesta de las células T a los patógenos. El bloqueo de estas vías puede mejorar la función de células T específicas [15, 16].

Los modelos clínicos predictivos desempeñan un papel crucial en el diagnóstico y la evaluación del pronóstico de enfermedades. Se han desarrollado diversos modelos predictivos para el cáncer de hígado, la fibrosis hepática y la insuficiencia hepática aguda sobre crónica relacionados con el VHB [17,18,19]. Sin embargo, los modelos para predecir la depuración del VHB no se han explorado ampliamente. Actualmente, se carece de modelos predictivos basados en marcadores inmunitarios para la depuración del VHB. Por lo tanto, nuestro objetivo es desarrollar un modelo predictivo para la depuración del VHB desde la perspectiva inmunitaria, centrándonos en los subgrupos de linfocitos T CD4+, las citocinas y los genes relacionados con los puntos de control inmunitarios.

Además, el rango de hospedadores del VHB es extremadamente limitado, ya que solo puede infectar a humanos y ciertos primates (como los chimpancés), pero no a la mayoría de las otras especies. Debido a restricciones éticas, el uso de modelos de primates está estrictamente regulado. Aunque los patos pueden infectarse con el virus de la hepatitis B del pato (DHBV), la homología entre el DHBV y el VHB es solo del 40%, lo que limita la aplicabilidad de este modelo en la investigación del VHB [20]. Si bien los ratones no pueden infectarse naturalmente con el VHB, Huang et al. lograron con éxito la expresión sostenida del ADN del VHB en hígados de ratones utilizando tecnología de inyección hidrodinámica (HI) [21]. Los estudios han demostrado que inyectar diferentes dosis de plásmidos afecta significativamente la duración de la persistencia del VHB en modelos de ratón: tanto las dosis insuficientes como las excesivas de plásmidos aceleran la eliminación del VHB, mientras que una dosis de 5 μg o 6 μg resulta en una presencia relativamente prolongada del VHB en los modelos de ratón [22, 23]. El seguimiento de la dinámica inmunológica de los individuos infectados por el VHB es un gran desafío; sin embargo, los modelos de ratón pueden simular la infección humana por el VHB, lo que proporciona una plataforma valiosa para analizar la dinámica inmunológica in vivo.

Este estudio busca explorar las interrelaciones entre la infección crónica por VHB y los subgrupos de linfocitos T CD4+, las citocinas y los puntos de control inmunitario. Además, buscamos desarrollar un modelo de predicción de la depuración del VHB basado en datos experimentales. Simultáneamente, mediante el establecimiento de un modelo murino de VHB, observaremos la evolución natural completa de la enfermedad. Este enfoque no solo facilita la comprensión de los mecanismos inmunopatológicos de la infección crónica por VHB, sino que también permite la observación dinámica de las interacciones mutuas entre el VHB y la inmunidad del huésped. Esta investigación es crucial para una mayor evaluación del estado de la infección por VHB y la predicción de su depuración.

La figura 1 ilustra el flujo de trabajo específico de este estudio, cuyo objetivo es mejorar la comprensión de los lectores sobre el proceso de investigación.

Diagrama de flujo. Hospital A: Segundo Hospital Afiliado a la Universidad Médica de Harbin; Hospital B: Hospital General del Grupo Industrial de Beidahuang

Toda la investigación con participantes humanos en este estudio fue aprobada por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Harbin (número de aprobación KY27-118), de conformidad con la Declaración de Helsinki, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética de la Universidad Médica de Harbin (número de aprobación SYDW2010-144) y de acuerdo con las directrices ARRIVE.

Español De septiembre de 2021 a diciembre de 2022, se obtuvieron muestras de sangre periférica anticoagulada con EDTA-K2 de 158 pacientes con VHB crónico y 152 individuos con VHB resuelto en el Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin. Entre marzo de 2025 y abril de 2025, se inscribieron de manera similar 51 individuos adicionales con VHB crónico y 50 individuos con VHB resuelto del Hospital General del Grupo Industrial de Beidahuang. Ambos grupos tenían más de 18 años. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: (1) Grupo de infección crónica por VHB: HBsAg sérico positivo y/o ADN del VHB durante más de 6 meses; (2) Grupo de VHB resuelto: HBsAg negativo, con HBsAb, HBeAb y HBcAb positivos, o HBeAb y HBcAb positivos solos o juntos. Los criterios de exclusión incluyeron: (1) Infección concurrente con otros virus; (2) Presencia de otras enfermedades físicas o mentales graves; (3) Uso de interferón, corticosteroides, inmunosupresores o quimioterapia. El diagnóstico clínico y los procedimientos de investigación se ajustaron a la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en este estudio.

Basándonos en la secuencia completa del genoma del subtipo C2 del VHB (GenBank: JQ688404.1) y el plásmido pAAV/HBV1.2 construido por Huang et al. [21], empleamos métodos de síntesis génica y recombinación homóloga. Específicamente, utilizamos la secuencia génica del VHB de 1,2 veces (nt1400-nt3182/1-nt1987) del plásmido pAAV/HBV1.2 como base. La secuencia diana, que comprende el segmento génico del VHB de 1,2 veces con ITR en ambos extremos, se dividió y se diseñó con cebadores adyacentes superpuestos que cubrían la secuencia diana. La amplificación por PCR proporcionó el segmento génico del VHB de 1,2 veces con ITR. Este segmento se recombinó posteriormente en el vector de destino pGL3-CP-Fluc (vector de corte enzimático Mlu I/Xho I) mediante recombinación homóloga, lo que resultó en el plásmido recombinante pGL3-CP-Fluc-HBV1.2c2, que contiene tanto el gen reportero como el genoma del VHB 1,2 veces mayor. Los procedimientos experimentales fueron realizados por el Instituto de Genómica Huada de Beijing Liuhe.

Se adquirieron ratones machos C57BL/6 de tipo silvestre del Centro de Experimentación Animal del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin o de Changsheng Biotechnology. Se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. El plásmido pGL3-CP-Fluc-HBV1.2C2 se transfectó en el hígado de ratones mediante HI para establecer un modelo murino de VHB [21]. Se inyectó sal potásica de D-luciferina (ST198, Beyotime, China) en la cavidad peritoneal del ratón y se colocó a los ratones en decúbito prono bajo un sistema de imágenes de animales vivos (Burker, Suiza) durante 3 min para detectar la intensidad de la expresión de luciferasa. Se midió el peso corporal de los ratones en diferentes momentos y se recogieron muestras de sangre.

Las PBMC de pacientes se aislaron como en estudios previos [24]. Las PBMC de ratón se aislaron con el kit de aislamiento de PBMC de ratón (LDS1090, TBDscienceHY, China). El ARN total de las PBMC se extrajo con el reactivo RNAkey™ (SM129-02, Sevenbio, China). 1 μg de ARN se convirtió en ADNc con el kit de síntesis de ADNc de primera cadena All-in-one II (SM143-02, Sevenbio, China). La RT-qPCR se realizó con la mezcla maestra SYBR Green (SM143-01, Sevenbio, China) y un equipo de RT-qPCR (SLAN-96p, Shanghai Hongshi, China). Los valores de ΔCT se normalizaron a β-actina. La detección del ADN del VHB se realizó con el kit de detección cuantitativa de ácidos nucleicos del VHB (SANSURE BIOTECH, China), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.

Tras centrifugar a 1091 g durante 15 min, se obtuvieron muestras de plasma de ratón. El plasma se diluyó 20 veces y se detectó HBsAg mediante un kit ELISA (Wantai, Pekín, China), siguiendo las instrucciones del fabricante. La densidad óptica (DO) de los pocillos de muestra se midió con un lector de microplacas (BIO-RAD, Estados Unidos) a longitudes de onda duales de 450 nm y 630 nm.

Para comprender las posiciones cromosómicas de los genes diana, utilizamos el paquete R "RCircos" para la visualización. La información sobre la ubicación cromosómica de los genes se obtuvo de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). A continuación, para determinar las posibles funciones y los mecanismos de las vías de los genes diana, realizamos un análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando los paquetes R "clusterProfiler", "org.Hs.eg.db", "enrichplot" y "ggplot2". Los resultados del enriquecimiento se filtraron con criterios de p < 0,05 y un valor de p ajustado < 0,05.

Este estudio empleó R (versión 4.2.2) y GraphPad (versión 9.1) para el análisis estadístico y la representación gráfica. Los datos métricos con distribución normal se presentan como media ± desviación estándar (x ± s), mientras que los datos métricos con distribución no normal se presentan como mediana y rango intercuartil. Se utilizó la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney para comparar los datos entre dos grupos. Para las comparaciones entre múltiples grupos, se utilizó la prueba ANOVA de una vía, la prueba de Kruskal-Wallis o la prueba T2 de Tamhane, con corrección de Bonferroni aplicada para las comparaciones por pares. Se utilizó la prueba de Spearman para el análisis de correlación. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para comparar dos tasas o proporciones. Se utilizaron curvas ROC para evaluar el rendimiento diagnóstico de genes o modelos. Se realizó un análisis de regresión logística binaria para el análisis multifactorial, se utilizó la selección por pasos para el cribado de variables, se verificó el factor de inflación de la varianza (VIF) para detectar colinealidad entre variables y se trazaron curvas de calibración y gráficos de columnas. Los análisis y visualizaciones utilizaron paquetes de R, como "pheatmap", "limma", "pROC", "fmsb", "SimDesign", "tdROC", "rmda", "rms", "regclass", "ResourceSelection" y "ggplot2". Un nivel de significancia de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

De acuerdo con los criterios de inclusión mencionados, se incluyó en este estudio a un total de 209 pacientes con VHB crónico y 202 pacientes con VHB en remisión. La Tabla 1 resume sus características clínicas. La comparación entre los grupos de pacientes de ambas instituciones médicas reveló diferencias estadísticamente significativas en los niveles de ALT (p < 0,001) y AST (p < 0,01), mientras que no se observaron diferencias significativas en la distribución por sexos (p > 0,05). Cabe destacar que se encontró una diferencia de edad significativa entre los pacientes con VHB crónico y los del grupo en remisión del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin (p < 0,001).

Según el orden de inscripción, los participantes del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin se dividieron en un grupo de entrenamiento (el primer 70%) y un grupo de validación interna (el 30%) con una proporción de 7:3. Como se muestra en la Tabla 2, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en las características basales, como la distribución por sexo, la edad y los niveles de ALT y AST, entre ambos grupos (p > 0,05 para todos).

Las Tablas 3 y 4 presentan las características basales de los participantes en el grupo de entrenamiento y el grupo de validación interna, respectivamente. En el grupo de entrenamiento, en comparación con el grupo con VHB resuelto, el grupo con infección crónica por VHB mostró diferencias significativas en los niveles de edad (P < 0,001), ALT (P < 0,001) y AST (P < 0,001), mientras que no se observó diferencia significativa en la distribución por sexos (P > 0,05). En el grupo de validación interna, los niveles de ALT (P < 0,001) y AST (P < 0,001) difirieron significativamente entre los grupos crónico y resuelto, mientras que la distribución por edad y sexo no mostró diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05). En resumen, la estratificación de entrenamiento-validación preservó eficazmente los parámetros basales equilibrados entre las cohortes del estudio.

Para comprender mejor los diez genes diana incluidos en este estudio, se visualizaron sus posiciones mediante un diagrama de circos (Fig. 2A). Mediante el análisis GO, el análisis de enriquecimiento reveló que, en la sección Proceso biológico (BP), se enriquecen principalmente en vías como la regulación de la adhesión leucocitaria. En la sección Componente celular (CC), se observó enriquecimiento principalmente en la cara externa de la membrana plasmática. En la sección Función molecular (MF), se observó enriquecimiento en actividades como la actividad represora de la transcripción de unión al ADN, específica de la ARN polimerasa II (Fig. 2B). Además, el análisis KEGG mostró que los genes diana se enriquecen predominantemente en vías relacionadas con la diferenciación de células Th17, Th1 y Th2, así como con la señalización del receptor de células T (TCR) (Fig. 2C).

Análisis bioinformático e identificación de DEG. A. Mapa circular de las posiciones cromosómicas de diez genes. B. Gráfico de burbujas del análisis de enriquecimiento de GO. C. Gráfico de burbujas del análisis de enriquecimiento de la vía KEGG. D. Diagrama de cajas de la expresión de ARNm de diez genes. E. Gráfico de correlación de la expresión de ARNm de ocho genes. F. Curva ROC de ocho genes.

Mediante RT-qPCR, se evaluaron los niveles de ARNm de 10 genes en 212 muestras de PBMC del grupo de entrenamiento, incluyendo 108 individuos con infección crónica por VHB y 104 individuos con infección resuelta por VHB. En el grupo con infección resuelta por VHB, los niveles de expresión de GATA3 (P < 0,001), FOXP3 (P < 0,001), TNF (P < 0,001), LAG3 (P = 0,034) y TIGIT (P < 0,001) fueron significativamente mayores en comparación con el grupo crónico, mientras que los niveles de expresión de IFNG (P < 0,001), CTLA4 (P < 0,001) y HAVCR2 (P = 0,002) fueron significativamente menores que en el grupo crónico. TBX21 y RORC no mostraron diferencias estadísticamente significativas (Fig. 2D). En el análisis de correlación, la mayoría de las expresiones génicas se correlacionaron positivamente, con FOXP3 mostrando correlaciones más altas con TNF (R = 0,48), LAG3 (R = 0,54) y TIGIT (R = 0,51). TIGIT exhibió altas correlaciones con GATA3 (R = 0,62) y LAG3 (R = 0,5). GATA3 y CTLA4 mostraron una correlación negativa significativa (R = −0,58) (Fig. 2E). El análisis ROC demostró que los valores de AUC para GATA3, FOXP3, IFNG, TNF, CTLA4, LAG3, TIGIT y HAVCR2 fueron 0,729, 0,689, 0,667, 0,663, 0,646, 0,584, 0,662 y 0,5623, respectivamente (Fig. 2F). Estos resultados indican que los niveles de expresión de los genes diana están correlacionados y poseen potencial diagnóstico.

Primero, incluimos ocho marcadores (GATA3, FOXP3, IFNG, TNF, CTLA4, LAG3, TIGIT y HAVCR2) que mostraron diferencias estadísticas en el modelo y realizamos un análisis de regresión logística. Los resultados se muestran en la Fig. 3A, donde CTLA4, LAG3 y TIGIT no exhibieron diferencias estadísticas. Posteriormente, utilizando AIC como criterio de selección, empleamos eliminación regresiva para seleccionar variables. El modelo final incluyó cinco marcadores (GATA3, FOXP3, IFNG, TNF y HAVCR2) (Fig. 3B). La fórmula del modelo es P = 1/[1 + e^(-(−0.34 + 0.854*expresión de GATA3 + 1.929*expresión de FOXP3—1.367*expresión de IFNG + 1.075*expresión de TNF—2.995*expresión de HAVCR2))].

Desarrollo y evaluación de modelos de predicción para la eliminación del VHB. A. Diagrama de bosque del análisis de regresión logística. B. Diagrama de bosque del análisis de regresión logística tras la selección de variables mediante eliminación regresiva. C. Diagrama de radar de los valores del factor de inflación de la varianza. D. Curva ROC del modelo de predicción. E. Gráfico de barras que compara el AUC del modelo de predicción con cinco genes. F. Gráfico de calibración del modelo. G. Nomograma que muestra la inclusión de cinco variables.

Para comprobar la multicolinealidad en el modelo, utilizamos el método VIF. Los resultados se muestran en la Fig. 3C. Los valores de VIF para las cinco variables fueron significativamente menores de 10, lo que indica que no existe multicolinealidad significativa entre ellas. Además, evaluamos el rendimiento diagnóstico del modelo mediante el análisis de la curva ROC. Con un valor de corte de 0,50919, el modelo presentó un AUC de 0,877 (Fig. 3D). Clasificamos el AUC del modelo de predicción y de los cinco genes, y el AUC del modelo fue significativamente mayor que el de los marcadores individuales (Fig. 3E).

Además, utilizamos curvas de calibración para evaluar el modelo. Los resultados se muestran en la Fig. 3F, demostrando una estrecha concordancia entre los resultados previstos y los reales. Posteriormente, con base en las cinco variables, construimos nomogramas para personalizar la evaluación de la probabilidad de eliminación del VHB en cada paciente. Las puntuaciones de cada marcador se derivaron a partir de sus valores de expresión, y estas puntuaciones se sumaron para determinar la puntuación total y, por lo tanto, evaluar la probabilidad de eliminación (Fig. 3G).

Utilizamos RT-qPCR para detectar los niveles de ARNm de genes modelo en 98 muestras de PBMC de una cohorte de validación interna, que incluyó 50 pacientes con infección crónica por VHB y 48 individuos con VHB resuelto. En el grupo resuelto, los niveles de expresión de GATA3, FOXP3 y TNF fueron significativamente mayores que en el grupo crónico (p < 0,001), mientras que los niveles de expresión de IFNG (p < 0,001) y HAVCR2 (p < 0,05) fueron menores que en el grupo crónico, en consonancia con las tendencias observadas en la cohorte de entrenamiento (fig. 4A). El análisis ROC mostró un AUC de 0,87 para la cohorte de prueba (fig. 4B).

Validación del modelo de predicción de la depuración del VHB. A. Diagrama de caja de la expresión de ARNm de los genes modelo en el grupo de validación interna. B. Curva ROC del modelo de predicción en el grupo de validación interna. C. Diagrama de caja de la expresión de ARNm de los genes modelo en el grupo de validación externa. D. Curva ROC del modelo de predicción en el grupo de validación externa.

Para evaluar la generalización y robustez del modelo, se utilizó una cohorte externa independiente del Hospital General del Grupo Beidahuang, compuesta por 51 pacientes con VHB crónico y 50 individuos con VHB resuelto, para la validación externa. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo crónico, el grupo resuelto exhibió niveles de expresión de ARNm de GATA3 significativamente mayores (P < 0,05), mientras que los niveles de expresión de IFNG (P < 0,001) y HAVCR2 (P < 0,05) fueron significativamente menores (Fig. 4C). El análisis de la curva ROC mostró un AUC de 0,861 en esta cohorte de validación externa (Fig. 4D). Aunque la magnitud de las diferencias en la expresión génica fue ligeramente menor en comparación con la cohorte de validación interna, el modelo aún mostró un alto rendimiento discriminatorio.

Basándonos en los efectos dosis-dependientes establecidos de la transfección plasmídica sobre la persistencia del VHB (6 μg: infección prolongada; 20 μg: aclaramiento rápido), seleccionamos dosis intermedias de 6 μg (que favorecen la persistencia) y 10 μg (aclaramiento moderado) para el análisis comparativo. Los plásmidos pGL3-CP-Fluc-HBV1.2C2 se disolvieron en solución salina estéril a estas concentraciones y se inyectó HI en ratones para establecer modelos murinos transfectados con VHB. Se midió el peso corporal y se extrajo sangre periférica regularmente (Fig. 5A). Como se muestra en la Fig. 5B, no hubo diferencias estadísticamente significativas en los pesos corporales iniciales ni en cada punto temporal entre los dos grupos (P > 0,05). Tras la inyección, los ratones mostraron una pérdida de peso inicial significativa al día siguiente a la infección (DPI) (P < 0,001), que aumentó gradualmente a partir de entonces. A los 3 DPI, los pesos fueron mayores que en el 1 DPI (P < 0,01), y a los 7 DPI, los pesos fueron mayores que en el 3 DPI (P < 0,001), sin diferencia estadística entre los pesos iniciales y los de los 7 DPI, lo que indica una recuperación a los niveles de peso inicial a los 7 DPI (Fig. 5C).

Observaciones dinámicas del peso corporal, HBsAg y los niveles de ADN del VHB en ratones transfectados con VHB. A. Diagrama esquemático del experimento con ratones transfectados con VHB. B. Gráfico lineal del peso corporal de los ratones. C. Gráfico de violín de pares de pesos corporales de ratones. D. Gráfico lineal del HBsAg. E. Las curvas de Kaplan-Meier mostraron las tasas acumuladas de eliminación del HBsAg en ratones. F. Gráfico lineal del ADN del VHB. G. Las curvas de Kaplan-Meier mostraron las tasas acumuladas de eliminación del ADN del VHB en ratones. Los grupos de 6 μg y 10 μg representan ratones inyectados con 6 μg y 10 μg del plásmido pGL3-CP-Fluc-HBV1.2C2, respectivamente.

Se extrajo sangre periférica de ratones en momentos específicos para la detección de HBsAg y ADN del VHB. No se observó diferencia estadística en los niveles de HBsAg entre los dos grupos el primer día de la administración (DPI), pero el tercer día de la administración, los niveles de HBsAg fueron significativamente mayores en el grupo de 6 μg que en el de 10 μg (P < 0,001). A partir del séptimo día de la administración, los niveles de HBsAg disminuyeron gradualmente en ambos grupos con el tiempo (Fig. 5D, Figura S1 A). Las curvas de Kaplan-Meier mostraron las tasas acumuladas de aclaramiento de HBsAg en ratones, y se observó una diferencia estadísticamente significativa en los tiempos de aclaramiento entre ambos grupos (P < 0,05); los ratones del grupo de 6 μg requirieron mayor tiempo para el aclaramiento de HBsAg (Fig. 5E).

En ambos grupos, el de 6 μg y el de 10 μg, se observó un aumento significativo en los niveles de HBsAg a los 3 DPI en comparación con el de 1 DPI (P < 0,05). Sin embargo, no se observó diferencia estadística en los niveles de HBsAg entre los 3 y los 7 DPI, mientras que los niveles de HBsAg disminuyeron significativamente a los 14 DPI en comparación con los 7 DPI (Figuras S1B-C).

En cuanto a la detección de ADN del VHB, los niveles de ADN del VHB fueron significativamente mayores en el grupo de 6 μg que en el grupo de 10 μg a los 7 y 35 DPI (P < 0,01). Los niveles de ADN del VHB disminuyeron gradualmente con el tiempo a partir del primer DPI en ambos grupos (Fig. 5F, Figuras S1D-F). Las curvas de Kaplan-Meier para el aclaramiento del ADN del VHB no mostraron diferencias estadísticamente significativas en los tiempos de aclaramiento entre ambos grupos (P > 0,05), lo que indica una mayor presencia de ADN del VHB en sangre periférica en comparación con el HBsAg (Fig. 5G).

Para observar la expresión de los plásmidos pGL3-CP-Fluc-HBV1.2C2 en el hígado de ratones, realizamos observaciones dinámicas mediante imágenes de fluorescencia en vivo. La intensidad de fluorescencia en el grupo de 10 μg fue significativamente mayor que en el grupo de 6 μg a los 1 DPI (P < 0,01), 3 DPI (P < 0,01), 7 DPI (P < 0,01) y 14 DPI (P < 0,05) (Fig. 6A, B). En todos los ratones, se observó una tendencia al aumento de la intensidad de fluorescencia a los 3 DPI en comparación con el 1 DPI, pero no fue estadísticamente significativa (P > 0,05), mientras que la intensidad de fluorescencia disminuyó significativamente a los 7 DPI (P < 0,001), y la mayoría de los ratones mostraron desaparición de la fluorescencia a los 14 DPI (Fig. 6C, Figuras S1G-H). En el análisis de correlación, los niveles de ADN del VHB se correlacionaron positivamente con la intensidad de fluorescencia (r = 0,46, P < 0,001), observándose una mayor correlación en el grupo de 6 μg (r = 0,6, P < 0,001) en comparación con el grupo de 10 μg (r = 0,4, P < 0,001) (Fig. 6D).

Observación dinámica de la intensidad de fluorescencia en ratones transfectados con VHB. A. Intensidad de fluorescencia en diferentes puntos temporales en dos grupos de ratones. B. Gráfico de líneas de la intensidad de fluorescencia. C. Gráfico de violín de la intensidad de fluorescencia de ratones pareados. D. Análisis de correlación entre la intensidad de fluorescencia y el ADN del VHB.

En resumen, nuestros hallazgos confirman que la dosificación de 6 μg de plásmido genera un modelo de persistencia del VHB duradero, creando condiciones para la elaboración de perfiles longitudinales de expresión génica inmunitaria.

En los puntos temporales designados, se practicó la eutanasia a los ratones y se recogieron muestras de sangre. Se aislaron las PBMC y se detectaron los niveles de ARNm de los genes diana mediante RT-qPCR. Para dilucidar los cambios dinámicos del ADN del VHB, el HBsAg y los genes relacionados con el sistema inmunitario, realizamos análisis longitudinales en los grupos de 6 μg y 10 μg. En el grupo de 6 μg, observamos un aumento gradual de la expresión de TNF que acompañó la disminución progresiva de los niveles de ADN del VHB y HBsAg. Cabe destacar que IFNG y HAVCR2 mostraron fluctuaciones transitorias a los 28 DPI, mientras que GATA3 mostró un patrón bifásico a los 42 DPI, con un aumento inicial seguido de una disminución significativa y luego un rebote (P < 0,05). La expresión de FOXP3 aumentó notablemente tanto a los 56 DPI como a los 112 DPI (Fig. 7A). Por el contrario, aunque el ADN del VHB y el HBsAg también disminuyeron gradualmente en el grupo de 10 μg, la mayoría de los genes inmunitarios se mantuvieron relativamente estables sin una tendencia ascendente sostenida. Sin embargo, se detectaron picos transitorios en IFNG y HAVCR2 a los 12 DPI, y el TNF fluctuó repetidamente a lo largo del período de observación (Fig. 7B). El análisis comparativo reveló diferencias significativas en los patrones de expresión temporal entre los dos grupos. El grupo de 6 μg exhibió una modulación inmunitaria más dinámica, con GATA3 significativamente regulado a la baja a los 42 DPI (P < 0,05) y regulado al alza a los 112 DPI (P < 0,05), y FOXP3 elevado a los 14 DPI (P < 0,05). Cabe destacar que la expresión de TNF rebotó a los 28 y 56 DPI (P < 0,05) en este grupo. Por el contrario, no se observaron diferencias significativas intergrupales en la expresión de HAVCR2 en ningún momento (Fig. 7C). Estos hallazgos demuestran un patrón temporal de regulación de genes inmunes, lo que sugiere que los grupos de 6 μg y 10 μg pueden involucrar mecanismos inmunomoduladores distintos durante la eliminación del VHB.

Observación dinámica de los niveles de expresión del gen modelo en ratones transfectados con VHB. A. Gráfico lineal que ilustra los cambios dinámicos en el ADN del VHB, el HBsAg y los niveles de expresión del gen modelo en el grupo de 6 μg. B. Gráfico lineal que ilustra los cambios dinámicos en el ADN del VHB, el HBsAg y los niveles de expresión del gen modelo en el grupo de 10 μg. C. Gráfico lineal de los niveles de expresión del ARNm del gen modelo en diferentes momentos en dos grupos de ratones.

La hepatitis C crónica (HBC), como problema de salud pública mundial, se asocia con aproximadamente un tercio de los casos de cirrosis y la mitad de los casos de carcinoma hepatocelular [25]. El curso natural de la infección crónica por VHB está determinado principalmente por cambios en las interacciones inmunitarias entre el virus y el huésped, que se caracterizan por variaciones en la carga viral, el estado del antígeno e y el grado de daño hepático en diferentes estadios clínicos [26]. Los mecanismos subyacentes a la infección viral persistente dependen no solo de las características biológicas del propio virus, sino también del estado de la respuesta inmunitaria del huésped.

En este estudio, establecimos un modelo predictivo inmunitario para la eliminación del VHB, identificando GATA3/FOXP3/IFNG/TNF/HAVCR2 como determinantes clave mediante validación multicéntrica. Cabe destacar que nuestros estudios murinos revelaron patrones temporales dosis-específicos de estos marcadores, lo que sugiere mecanismos inmunorreguladores distintos entre infecciones crónicas y resueltas.

Los mecanismos inmunológicos que subyacen a la depuración del VHB parecen implicar interacciones complejas entre múltiples poblaciones de células inmunitarias. GATA-3 desempeña un papel fundamental en la diferenciación de las células Th2, cuya expresión podría estar regulada por la vía IL-4/STAT6, a la vez que es inhibida recíprocamente por la actividad de las células Th1. Esta respuesta equilibrada Th1/Th2 en individuos con infección resuelta probablemente facilita la activación de las células B y la restauración de la función inmunitaria humoral, como lo respaldan estudios previos [27, 28]. Los patrones de expresión de Foxp3 observados en nuestro estudio presentan una paradoja intrigante. Si bien la infección crónica por VHB suele presentar un aumento en la frecuencia de células Treg, nuestros casos resueltos mostraron un patrón temporal distintivo de regulación de Foxp3. Nuestra hipótesis es que esto podría representar un mecanismo compensatorio mediante el cual la expansión transitoria de Treg ayuda a mitigar el daño hepático inmunomediado sin comprometer el desarrollo de células T CD8+ específicas del VHB ni de células T de memoria [29, 30]. La expresión elevada de IFNG en el grupo infectado por el VHB puede reflejar que algunos pacientes se encontraban en la fase de aclaramiento inmunitario o en la etapa activa de la enfermedad. Esta interpretación está respaldada por las características clínicas que muestran niveles significativamente más altos de ALT y AST en el grupo crónico en comparación con el grupo autolimitado, lo que sugiere una inflamación hepática en curso. El doble papel de las citocinas inflamatorias en la infección por el VHB fue particularmente evidente en nuestros resultados. TNF-α e IFN-γ demostraron asociaciones divergentes: mientras que los niveles elevados de TNF-α en las PBMC mostraron una fuerte correlación con el aclaramiento viral, los niveles elevados de IFN-γ se asociaron de forma más significativa con la inflamación hepática. Esta dicotomía subraya el delicado equilibrio entre el control viral y la inmunopatología en la infección por el VHB [31]. Nuestros datos revelan además patrones inesperados en la expresión de los puntos de control inmunitarios. A diferencia de los marcadores de agotamiento convencionales observados en las infecciones crónicas, el grupo resuelto exhibió una regulación negativa de CTLA-4 y TIM-3 junto con una expresión elevada de LAG3 y TIGIT. Este sorprendente hallazgo desafía los paradigmas actuales y sugiere que estas moléculas podrían desempeñar funciones más matizadas en la eliminación del VHB de lo que se reconocía previamente [32]. Los distintos perfiles de expresión de estos reguladores inmunitarios en infecciones resueltas y crónicas apuntan a mecanismos de control viral potencialmente novedosos que justifican una mayor investigación.

El desarrollo de modelos murinos fiables para la investigación del VHB y del sistema inmunitario del huésped representa un avance crucial en este campo. En nuestro estudio, establecimos con éxito un sistema experimental robusto mediante la inyección hidrodinámica de concentraciones variables (6 μg y 10 μg) del plásmido pGL3-CP-Fluc-HBV1.2C2 en hígados de ratones, lo que permitió la monitorización dinámica integral de los parámetros virales e inmunológicos. La reducción transitoria del peso corporal observada inmediatamente después de la inyección, seguida de una recuperación completa sin mortalidad, confirma la seguridad del procedimiento y coincide con informes previos de efectos adversos mínimos [33]. Nuestros análisis virológicos revelaron varios hallazgos importantes sobre la dinámica del VHB. Ambos grupos experimentales presentaron niveles máximos de HBsAg aproximadamente una semana después de la inyección, lo que coincide con la cinética descrita para la transfección del plásmido pAAV/HBV 1.2 [22]. Aunque el grupo de 6 μg demostró mayores niveles de HBsAg a los 3 DPI (un hallazgo que inicialmente parece contra-intuitivo con respecto a la respuesta a la dosis), esta observación en realidad corrobora el informe de Wang et al. de niveles iniciales de HBsAg similares después de inyecciones de 6 μg y 20 μg [23]. La aparente discrepancia entre la intensidad de la fluorescencia (consistentemente mayor en el grupo de 10 μg) y los niveles de HBsAg puede reflejar diferencias fundamentales en la eficiencia de la traducción de proteínas virales, la cinética de secreción o la estabilidad, aunque los mecanismos precisos requieren mayor investigación. Las implicaciones inmunológicas de nuestros hallazgos son particularmente notables. El análisis de Kaplan-Meier demostró claramente una depuración más rápida de HBsAg en el grupo de 10 μg, lo que respalda observaciones previas de que las dosis más altas de plásmidos se correlacionan con una depuración viral acelerada [23]. Este fenómeno refleja las observaciones clínicas en modelos de chimpancés, donde la exposición a altas dosis de VHB resulta en una infección limitada de hepatocitos y una reducción del daño hepático inmunomediado en comparación con la exposición a bajas dosis [34]. La recapitulación de nuestro modelo del patrón clínico bien documentado de depuración del ADN del VHB que se retrasa con respecto a la depuración del HBsAg valida aún más su relevancia fisiológica [35]. Los datos de imágenes en vivo proporcionaron información única sobre los eventos tempranos de replicación viral, con un pico de intensidad de fluorescencia a los 3 DPI, notablemente antes del pico del HBsAg. Este patrón temporal refleja la cascada molecular de la replicación del VHB: transcripción inicial impulsada por plásmidos de pgRNA y otros ARNm virales, formación de intermediarios de replicación, traducción proteica posterior y secreción final; procesos que necesariamente introducen retrasos mensurables entre la administración del plásmido y la antigenemia detectable. Este completo modelo murino captura con éxito múltiples aspectos clave de la infección por VHB humano y la dinámica de depuración, a la vez que ofrece ventajas únicas para la monitorización en tiempo real de la actividad viral. Los efectos dependientes de la dosis observados en nuestro sistema brindan información valiosa para comprender las interacciones inmunovirales y pueden informar futuras estrategias terapéuticas destinadas a modular estas respuestas.

Nuestro análisis longitudinal reveló que distintas dosis de plásmido pueden configurar paisajes inmunitarios cualitativamente diferentes, lo que en última instancia influye en la cinética y los resultados de la depuración del HBsAg. Los ratones que recibieron 6 μg de plásmido desarrollaron una respuesta inmunitaria más prolongada pero regulada, caracterizada por la expresión sostenida de GATA3, FOXP3 y TNF. Este perfil puede reflejar un entorno inmunitario más tolerogénico o modulado, lo que podría retrasar la depuración viral a pesar de la activación de vías inmunitarias clave. Por el contrario, el grupo de 10 μg presentó una respuesta más temprana y más proinflamatoria, marcada por niveles elevados de IFNG y TNF y una expresión reducida de FOXP3 en el punto crítico de 14 días después de la inmunización, lo que probablemente aceleró la depuración del antígeno. El TNF, en particular, puede desempeñar un papel central en la mediación de estas diferencias. Ejerce actividad antiviral a través de múltiples mecanismos, incluyendo la reducción de la entrada viral en los hepatocitos, la alteración de las nucleocápsides que conduce a la degradación del ADNccc y la supresión indirecta de la transcripción y replicación del VHB mediante la modulación de la proteína inhibidora de FLICE celular (c-FLIP) [36,37,38]. Por lo tanto, la regulación positiva temprana del TNF en el grupo de 10 μg puede contribuir mecánicamente a su eliminación viral más eficiente, mientras que la inducción tardía del TNF en el grupo de 6 μg podría explicar su resolución más lenta.

Estos hallazgos apuntan a una polarización inmunitaria dependiente de la dosis, donde dosis más bajas pueden favorecer una activación inmunitaria equilibrada y la retroalimentación reguladora, mientras que dosis más altas impulsan respuestas inflamatorias más fuertes que eliminan el virus con mayor eficacia. Cabe destacar que el patrón bifásico de GATA3 en el grupo de 6 μg sugiere una participación dinámica de Th2 a lo largo del tiempo, lo que subraya aún más la compleja interacción entre la regulación inmunitaria y la eficacia antiviral. En conjunto, nuestros datos sugieren que, incluso con un contenido antigénico idéntico, la magnitud de la estimulación inmunitaria altera profundamente las interacciones huésped-virus, inclinando la balanza entre la persistencia y la eliminación. Esto resalta la importancia de la dosis del inmunógeno no solo para la magnitud de la respuesta, sino también para la trayectoria inmunitaria cualitativa, un factor clave para optimizar el diseño de vacunas terapéuticas contra el VHB.

Aunque este estudio proporciona información valiosa, se deben reconocer varias limitaciones. En primer lugar, al recopilar información de los dos grupos de participantes, no fue posible determinar con precisión el momento de la infección por VHB ni el momento exacto de su eliminación. En segundo lugar, el diseño unicéntrico y la restricción regional de nuestra población de estudio pueden limitar la generalización de nuestros hallazgos. En cuanto a los experimentos con animales, si bien realizamos un análisis longitudinal exhaustivo, el volumen limitado de sangre periférica en cada animal planteó limitaciones técnicas que nos impidieron rastrear los perfiles de PBMC del mismo ratón en diferentes momentos. Como resultado, se tuvieron que utilizar diferentes ratones en cada momento, lo que pudo haber introducido variabilidad interindividual. No obstante, nuestro estudio presenta importantes fortalezas que mitigan estas limitaciones. El modelo predictivo se desarrolló utilizando una muestra de gran tamaño y se validó rigurosamente en una cohorte independiente. Cabe destacar que los patrones de expresión conservados de GATA3 y TNF entre el grupo de ratones tratados con 6 μg y las PBMC humanas sugieren firmemente su papel crucial en el mecanismo de eliminación del HBsAg. Esta consistencia entre especies mejora la relevancia biológica de nuestros hallazgos y apoya su potencial valor traslacional.

Seleccionamos cinco genes (GATA3, FOXP3, IFNG, TNF y HAVCR2) como genes modelo y desarrollamos un modelo para predecir la eliminación de la infección por VHB basado en su expresión de ARNm, demostrando una buena capacidad predictiva. Observamos el curso natural de la infección por VHB utilizando un modelo murino transfectado con VHB.

No se generaron ni analizaron conjuntos de datos durante el presente estudio.

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No aplicable.

El presente estudio fue financiado por el Fondo Especial para Investigación Clínica de la Fundación Médica Wu Jieping (320.6750.18230).

Rongzheng Zhang, Han Qiao y Kun Zhou, estos autores, contribuyeron por igual a este trabajo.

Centro de Investigación Científica, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin, Harbin, 150000, China

Rongzheng Zhang, Han Qiao, Kun Zhou, Xinyang Cao, Meng Wu, Le Yu y Shuyun Zhang

Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital General del Grupo Industrial Beidahuang, Harbin, 150000, China

Kun Zhou

Departamento de Laboratorio Clínico, Primer Hospital Clínico de la Academia de Medicina Tradicional China de Jilin, Changchun, 130000, China

Xiao Mei Ju

Departamento de Inmunología, Universidad Médica de Harbin, Harbin, 150000, China

Jian Ming Dong

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ZR concibió el experimento. ZR, JX, CX y QH lo llevaron a cabo. WM colaboró con la edición del manuscrito. YL contribuyó a la curación de datos. ZR y DJ realizaron el análisis estadístico y la generación de figuras. ZR y ZK escribieron el borrador inicial del manuscrito. ZS revisó y editó el manuscrito. ZS supervisó el proyecto. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Shuyun Zhang.

No aplicable.

Los autores declaran no tener intereses en conflicto.

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Recibido: 24 de enero de 2025

Aceptado: 13 de mayo de 2025

Publicado: 21 de mayo de 2025

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-025-02792-w

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